Свойства и биологическая роль белков. Белки как гидрофильные коллоиды. Методы очистки и разделения белков.

Биохимия, биохимия полости рта — СПбГПМУ, Стоматологический факультет

Свойства белков

Белки — это высокомолекулярные азотсодержащие биополимеры, мономерами которых являются α-аминокислоты, соединённые пептидными связями. Их физико-химические свойства определяются аминокислотным составом, пространственной структурой и условиями среды.

Основные физико-химические свойства

• Молекулярная масса: варьирует от нескольких тысяч до миллионов дальтон (Да). Пример: инсулин — ~5 700 Да, тиреоглобулин — ~660 000 Да.
• Амфотерность: белки содержат свободные амино- (основные) и карбоксильные (кислотные) группы, поэтому способны диссоциировать как кислоты и как основания. Состояние, при котором суммарный заряд молекулы равен нулю, называется изоэлектрической точкой (pI). В pI растворимость и гидратация белка минимальны.
• Денатурация: потеря нативной (природной) пространственной конформации под действием физических (нагревание, УФ-излучение) или химических (кислоты, щёлочи, тяжёлые металлы, мочевина) факторов. Денатурация может быть обратимой (ренатурация) или необратимой.
• Гидратация: белки удерживают значительное количество воды (до 70% массы) за счёт водородных связей гидрофильных групп с молекулами воды.
• Коллоидные свойства: белки образуют коллоидные растворы (золи) благодаря большим размерам молекул и наличию гидратной оболочки.

Биологическая роль белков

Белки выполняют в организме фундаментальные функции, без которых невозможно существование клетки. Ниже перечислены основные классы их биологической активности.

• Каталитическая (ферментативная): подавляющее большинство химических реакций в организме катализируется белками-ферментами (пепсин, трипсин, ДНК-полимераза). Ферменты ускоряют реакции в миллионы раз без изменения направления равновесия.
• Структурная (пластическая): белки входят в состав цитоскелета (тубулин, актин), соединительной ткани (коллаген, эластин, кератин). Они обеспечивают механическую прочность и упругость тканей.
• Транспортная: перенос различных веществ через мембраны и с током крови. Примеры: гемоглобин (транспорт O₂ и CO₂), альбумин (транспорт жирных кислот, билирубина, лекарств), трансферрин (транспорт Fe²⁺).
• Защитная: иммуноглобулины (антитела) связывают и нейтрализуют чужеродные антигены; белки системы комплемента участвуют в уничтожении бактерий; интерфероны — противовирусная защита; белки острой фазы (С-реактивный белок) — неспецифическая защита.
• Регуляторная: многие гормоны являются белками или пептидами (инсулин, глюкагон, соматотропин). Рецепторы клеточных мембран также имеют белковую природу.
• Рецепторная: белки-рецепторы на поверхности клеток специфически связывают сигнальные молекулы (гормоны, нейромедиаторы) и передают сигнал внутрь клетки.
• Сократительная (моторная): актин и миозин обеспечивают мышечное сокращение, а также внутриклеточный транспорт с помощью кинезинов и динеинов.
• Энергетическая: в условиях голодания или длительной физической нагрузки белки могут использоваться как источник энергии (распад до аминокислот и дезаминирование — около 4 ккал/г). В норме эта функция второстепенна.
• Буферная: белки плазмы крови (особенно гемоглобин в эритроцитах) участвуют в поддержании кислотно-основного равновесия (способны связывать H⁺ и OH⁻).

> [!simple] Простыми словами: Белки — это «рабочие лошадки» клетки. Они строят ткани, управляют химическими реакциями, защищают организм, переносят вещества и сжимают мышцы. Без белков жизнь невозможна.

---

Белки как гидрофильные коллоиды

Белки в водных растворах образуют гидрофильные коллоиды — дисперсные системы, в которых частицы белковых макромолекул размером от 1 до 100 нм равномерно распределены в воде и окружены гидратной оболочкой.

Факторы устойчивости коллоидных растворов белков

• Заряд молекулы: при pH, отличном от pI, белок несёт одноимённый электрический заряд. Силы электростатического отталкивания препятствуют агрегации частиц.
• Гидратная оболочка: полярные и ионизированные группы (NH₃⁺, COO⁻, OH) связывают диполи воды, образуя слой из нескольких сотен молекул воды на 1 молекулу белка. Эта оболочка предотвращает сближение и слипание коллоидных частиц.

Процессы, характерные для гидрофильных коллоидных систем

• Высаливание — осаждение белка под действием высоких концентраций нейтральных солей (например, (NH₄)₂SO₄, NaCl). Соль дегидратирует белок (разрушает гидратную оболочку) и нейтрализует заряд. Это обратимый процесс — после удаления соли (диализ) белок может вернуться в растворимое состояние.

> [!example] Пример: Высаливание глобулинов плазмы крови полунасыщенным раствором сульфата аммония; альбумины высаливаются при полном насыщении.

• Коагуляция — необратимое слипание частиц с потерей нативной структуры. Характерна для необратимой денатурации (например, при кипячении яичного белка — молочно-белый сгусток).
• Пептизация — переход осадка белка обратно в коллоидный раствор при добавлении небольшого количества воды или электролита (используется редко в лабораторной практике).

> [!critical] Ключевой факт: Растворимость белка минимальна в изоэлектрической точке (pI), так как отсутствует электростатическое отталкивание. Любые факторы, снижающие заряд или разрушающие гидратную оболочку, вызывают высаливание или коагуляцию.

---

Методы очистки и разделения белков

Очистка белков — серия последовательных операций, направленных на выделение индивидуального белка из гомогената ткани или биологической жидкости с сохранением его нативной структуры и активности.

Основные этапы (общая схема)

1. Гомогенизация (разрушение клеток) → получение грубого экстракта.

2. Фракционирование (осаждение, центрифугирование) — удаление балластных компонентов.

3. Хроматографические методы — тонкое разделение по размеру, заряду, аффинности.

4. Электрофоретические методы — анализ чистоты и идентификация.

5. Концентрирование (лиофилизация, ультрафильтрация).

Методы разделения

1. Высаливание и осаждение органическими растворителями

• Высаливание: добавление нейтральных солей (сульфат аммония, сульфат натрия) в возрастающих концентрациях. Каждый белок осаждается при определённой концентрации соли. Наиболее распространённый метод начального фракционирования.
• Осаждение органическими растворителями (ацетон, этанол) при низких температурах (0…−10 °C). Растворитель снижает диэлектрическую проницаемость воды, уменьшает гидратацию и вызывает осаждение. Недостаток — возможна денатурация при неправильном режиме.

2. Диализ и ультрафильтрация

• Диализ: через полупроницаемую мембрану (целлофан, диализная трубка) из раствора удаляются низкомолекулярные примеси (соли, сахара). Макромолекулы белка остаются внутри.
• Ультрафильтрация: фильтрация через мембраны с заданным размером пор под давлением (например, для концентрирования раствора или фракционирования по молекулярной массе).

3. Гель-хроматография (гель-фильтрация)

Разделение основано на разнице в размере молекул. Колонка заполнена пористыми гранулами декстрана (Sephadex) или агарозы. Крупные белки не входят в поры и элюируются (выходят) первыми; мелкие задерживаются в порах и выходят позже.

> [!formula] Уравнение распределения в гель-хроматографии

>

> где — коэффициент доступности (чем больше, тем мельче белок), — объём элюции белка, — свободный объём колонки (вне пористого материала), — общий объём колонки.

4. Ионообменная хроматография

Разделение по суммарному заряду. Используют твёрдый носитель с ковалентно пришитыми заряженными группами:

• Катионообменники (сульфогруппы –SO₃⁻, карбоксильные –COO⁻) — удерживают положительно заряженные белки (при pH < pI).
• Анионообменники (четвертичные аммониевые группы) — удерживают отрицательно заряженные белки (при pH > pI).

Элюция проводится градиентом pH или ионной силы (NaCl). Белки выходят в порядке возрастания сродства к обменнику.

5. Аффинная хроматография

Высокоспецифичный метод, основанный на обратимом связывании белка с лигандом, иммобилизованным на матрице (субстрат фермента, антиген для антитела, лектин для гликопротеинов). Целевой белок элюируется конкурентным лигандом или изменением pH. Позволяет получить белок высокой чистоты за один цикл.

6. Электрофоретические методы

Разделение заряженных молекул в электрическом поле.

• Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ)
• SDS-PAGE (с додецилсульфатом натрия): SDS придаёт белкам одинаковый отрицательный заряд, разделение происходит только по молекулярной массе.
• Изоэлектрофокусирование (ИЭФ): создаётся градиент pH в геле, белки мигрируют до достижения своего pI и останавливаются.
• Двумерный электрофорез: комбинация ИЭФ (по pI) и SDS-PAGE (по массе) — позволяет разделить тысячи белков из клеточного лизата.

> [!simple] Простыми словами: Чтобы выделить конкретный белок, его сначала осаждают солью, затем пропускают через колонки, где он отделяется от примесей по размеру (гель-фильтрация), по заряду (ионообменная хроматография) или по специфическому связыванию (аффинная). Чистоту проверяют с помощью электрофореза.

7. Ультрацентрифугирование

Разделение по массе и плотности при высоких центробежных ускорениях (до 500 000 g). Различают:

• Аналитическое ультрацентрифугирование — для определения осадочной постоянной S (числа Сведберга), характеризующей молекулярную массу и форму белка.
• Препаративное ультрацентрифугирование — фракционирование в градиенте плотности сахарозы или бромида цезия.

---

> [!critical] Ключевой факт: Комбинация методов — правило современной очистки белков. Ни один метод не даёт 100% чистоты (кроме, возможно, аффинной при идеальных условиях). Стандартная стратегия: высаливание → ионообменная хроматография → гель-фильтрация → аффинная хроматография. Контроль чистоты — электрофорез в ПААГ (SDS-PAGE) и определение удельной активности фермента.

---

Итог. Белки — высокомолекулярные амфотерные коллоиды, выполняющие каталитические, структурные, транспортные и другие жизненно важные функции. Их гидрофильные коллоидные свойства определяют растворимость и стабильность в водной среде. Для очистки белков используют последовательные методы фракционирования (высаливание, хроматография, электрофорез), основанные на различии в размере, заряде и специфическом связывании.

Все вопросы раздела: Подготовка к экзамену по Биохимии, биохимии полости рта