Биохимия, биохимия полости рта — СПбГПМУ, Стоматологический факультет
Молекулярная масса (ММ) белка — это сумма атомных масс всех атомов, входящих в состав его молекулы. Выражается в дальтонах (Да) или килодальтонах (кДа). 1 Да = 1,66054 × 10⁻²⁴ г (атомная единица массы). ММ белков варьирует в широких пределах: от нескольких кДа (например, инсулин ~5,8 кДа) до сотен кДа и даже МДа (например, титин — мышечный белок с ММ ~3–4 МДа).
Факторы, определяющие молекулярную массу:
> [!simple] Простыми словами: Молекулярная масса белка — это «вес» одной его молекулы, измеряемый в дальтонах. Она зависит от того, насколько длинная цепочка аминокислот, есть ли дополнительные «прицепленные» сахара или жиры, а также из скольких частей (субъединиц) собран белок.
Форма белка определяется его пространственной конфигурацией (конформацией) — укладкой полипептидной цепи в пространстве. Различают три основных типа формы:
1. Глобулярные белки — компактные, сферические или эллипсоидные частицы. Характерны для ферментов, транспортных белков (альбумин, гемоглобин). Обычно растворимы в воде.
2. Фибриллярные белки — вытянутые, нитевидные или палочковидные молекулы. Выполняют структурную функцию (коллаген, эластин, фиброин шёлка). Часто нерастворимы.
3. Мембранные белки — пронизывают липидный бислой; их форма включает внеклеточные и цитоплазматические домены, а также трансмембранные спирали.
Форма зависит от аминокислотной последовательности (первичной структуры) и характера фолдинга (сворачивания), который определяют водородные связи, гидрофобные взаимодействия, ионные пары и дисульфидные мостики.
> [!example] Пример: Гемоглобин — глобулярный белок тетрамерной структуры (α₂β₂). Его форма близка к сфере диаметром около 5,5 нм. Коллаген — фибриллярный белок, состоящий из трёх полипептидных цепей, закрученных в тройную спираль длиной ~300 нм и толщиной ~1,5 нм.
Линейные размеры белка обычно выражают в нанометрах (нм) или ангстремах (Å). Для глобулярных белков определяют диаметр или радиус инерции (). Для фибриллярных — длину и поперечное сечение.
Примерные соотношения:
Размеры зависят от степени гидратации (белок в растворе окружён гидратной оболочкой) и конформационной подвижности.
Принцип: разделение молекул по размеру (гидродинамическому объёму) при прохождении через колонку с пористым гелем. Крупные белки элюируются раньше, мелкие — позже. ММ определяют по калибровочному графику (зависимость объёма элюции от логарифма ММ стандартных белков).
Принцип: SDS денатурирует белок, придавая ему отрицательный заряд, пропорциональный массе; при электрофорезе в геле с градиентом пор подвижность обратно пропорциональна логарифму ММ. После окрашивания геля сравнивают положение полос с маркерами молекулярных масс.
> [!formula] Расчёт ММ по SDS-PAGE
>
> где — относительная подвижность (расстояние, пройденное белком, делённое на расстояние фронта красителя), и — постоянные, определяемые по калибровке.
Принцип: при центрифугировании в градиенте плотности устанавливается равновесие между седиментацией и диффузией. ММ вычисляют по распределению концентрации вдоль центрифужной ячейки через уравнение:
где , — концентрации на расстояниях , от оси вращения; — универсальная газовая постоянная; — температура; — парциальный удельный объём белка; — плотность растворителя; — угловая скорость.
Принцип: дифракция рентгеновских лучей на кристаллах белка. Позволяет получить трёхмерную структуру с атомным разрешением (0,1–0,3 нм). Определяет точные координаты атомов, форму и размеры молекулы.
Принцип: измерение взаимодействий между магнитными ядрами (¹H, ¹³C, ¹⁵N) в растворе. По данным химических сдвигов и ядерного эффекта Оверхаузера (NOE) восстанавливают пространственную структуру.
Принцип: визуализация белковых частиц в тонком слое замороженного раствора с помощью электронного микроскопа при низких температурах. После усреднения множества изображений получают 3D-реконструкцию с разрешением до 0,2–0,4 нм.
Принцип: измерение флуктуаций интенсивности рассеянного света, обусловленных броуновским движением частиц. Определяют коэффициент диффузии , а затем гидродинамический радиус через уравнение Стокса — Эйнштейна:
где — постоянная Больцмана, — температура, — вязкость растворителя. даёт эффективный размер гидратированного белка.
Принцип: рассеяние рентгеновских лучей под малыми углами (0,1–10°) в растворе. По кривой интенсивности восстанавливают функцию парных расстояний и радиус инерции . Моделирование формы позволяет определить очертания молекулы (объём, асимметрию).
Позволяет определить коэффициент седиментации , который связан с ММ и формой через уравнение Сведберга:
где — число Авогадро, — коэффициент трения. По и (из другого метода) вычисляют коэффициент трения , а по нему — фактор формы (отношение , где — коэффициент трения эквивалентной сферы). Для несферических частиц , что указывает на вытянутую или уплощённую форму.
> [!critical] Ключевой факт: Молекулярную массу белков наиболее точно определяют масс-спектрометрией (MALDI-TOF, ESI), а форму и размеры — рентгеноструктурным анализом или крио-ЭМ. Для растворов незаменимы DLS и SAXS, которые дают гидродинамический радиус и радиус инерции соответственно.
---
Итог. Молекулярная масса белка — фундаментальная характеристика, определяемая длиной цепи и модификациями; форма и размеры зависят от укладки полипептидной цепи. Для их измерения применяют набор методов: хроматографические (гель-фильтрация), электрофоретические (SDS-PAGE), спектроскопические (масс-спектрометрия, DLS, SAXS) и структурные (РСА, ЯМР, крио-ЭМ). Выбор метода диктуется целями исследования и свойствами конкретного белка.
Все вопросы раздела: Подготовка к экзамену по Биохимии, биохимии полости рта