Методы разделения смесей белков. Значение хроматографического и электрофоретического исследования белков плазмы крови. Белковые фракции плазмы крови, причины их изменения.

Биохимия — СЗГМУ, Лечебное дело

Методы разделения смесей белков

Смеси белков разделяют, используя различия в их физико-химических свойствах: растворимости, молекулярной массе, суммарном электрическом заряде, изоэлектрической точке, сродстве (аффинности) к определённым лигандам. Основные методы разделения делятся на несколько групп.

Методы, основанные на различиях в растворимости

• Высаливание (солевое осаждение). Добавление нейтральных солей (сульфат аммония, хлорид натрия) уменьшает гидратную оболочку белка, что приводит к его агрегации и осаждению. Разные белки осаждаются при различной концентрации соли. Это позволяет получить грубую фракцию (например, альбумины и глобулины путём последовательного насыщения сульфатом аммония: глобулины при 50% насыщения, альбумины — при 100%).
• Изоэлектрическое осаждение. При значении pH, равном изоэлектрической точке (pI) белка, его суммарный заряд равен нулю. В этой точке растворимость белка минимальна, что используется для осаждения.

Методы, основанные на различиях в молекулярной массе

• Диализ. Малые молекулы (соли, низкомолекулярные метаболиты) проходят через полупроницаемую мембрану, а белки задерживаются. Используется для смены буфера или удаления низкомолекулярных компонентов.
• Ультрафильтрация. Вариант диализа под давлением. Применяют мембраны с определённым порогом отсечения по молекулярной массе (MWCO). Белки, молекулярная масса которых меньше порога, проходят через мембрану, более крупные — задерживаются. Позволяет концентрировать и фракционировать белки.
• Гель-фильтрация (эксклюзионная хроматография). Разделение происходит в колонке, заполненной пористыми гранулами (сефадекс, сефароза). Крупные белки не проникают в поры и элюируются первыми (свободный объём). Мелкие белки заходят в поры, задерживаются и выходят позже. Ключевая величина — коэффициент распределения , где — объём элюции белка, — свободный объём колонки, — общий объём колонки.
• Ультрацентрифугирование. Разделение по коэффициенту седиментации (S) в градиенте плотности (сахароза, CsCl). Чем больше молекулярная масса и компактнее белок, тем быстрее он оседает под действием центробежной силы.

Методы, основанные на различиях в заряде

• Электрофорез. Движение заряженных молекул в электрическом поле. Скорость миграции определяется электрофоретической подвижностью и напряжённостью поля : . В свою очередь , где — суммарный заряд белка, — коэффициент трения (зависит от размера и формы молекулы). Разделение проводят в поддерживающих средах: бумага, агарозный гель, полиакриламидный гель (ПААГ). Денатурирующий электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) позволяет разделять белки практически только по молекулярной массе, так как SDS придаёт всем белкам одинаковое отношение заряд/масса.
• Ионообменная хроматография. Разделение по знаку и величине заряда. Используют сорбенты с ковалентно присоединёнными заряженными группами: катионообменники (сульфопропил, карбоксиметил) связывают катионы, анионообменники (диэтиламиноэтил — DEAE) связывают анионы. Белок элюируют градиентом соли (NaCl) или изменением pH. Чем больше заряд белка, тем сильнее он связывается и тем позднее выходит.

Метод, основанный на биологической специфичности

• Аффинная хроматография. Высокоспецифичный метод, использующий обратимые взаимодействия «лиганд — белок» (антиген-антитело, фермент-ингибитор, рецептор-гормон). Лиганд ковалентно прикрепляют к матрице (агароза). Белок, имеющий сродство к этому лиганду, связывается, а все остальные белки вымываются. Целевой белок затем элюируют с помощью раствора, нарушающего связь (высокая концентрация свободного лиганда, изменение pH). Это позволяет выделить белок в одну стадию высокой степени чистоты.

---

Значение хроматографического и электрофоретического исследования белков плазмы крови

Значение хроматографического исследования

• Количественное определение индивидуальных белков. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и аффинная хроматография позволяют точно измерить концентрацию конкретных белков плазмы (например, гликированного гемоглобина HbA1c при сахарном диабете, α-фетопротеина при гепатоцеллюлярной карциноме, тропонина при инфаркте миокарда).
• Исследование изоформ и посттрансляционных модификаций. С помощью хроматографии (например, ионообменной ВЭЖХ гемоглобина) выявляют аномальные варианты гемоглобина при гемоглобинопатиях (серповидноклеточная анемия, талассемии). Также можно анализировать профиль гликофоринов эритроцитов.
• Автоматизация и высокая воспроизводимость. Хроматографические анализаторы (например, для определения HbA1c или неоптерина) обеспечивают стандартизованный результат, пригодный для мониторинга заболевания в динамике.
• Скрининг и подтверждение парапротеинемий. Аффинная хроматография с иммобилизованными антителами против иммуноглобулинов используется для количественного определения моноклональных белков (парапротеинов) при миеломной болезни.

Значение электрофоретического исследования

• Скрининг диспротеинемий. Электрофорез белков сыворотки крови (обычно на агарозном геле) является «золотым стандартом» первичного выявления нарушений количественного и качественного состава белков. Он даёт общую картину — белковую электрофореграмму, на которой выделяют 5–6 фракций.
• Выявление моноклональных гаммапатий. Наличие узкой, интенсивной полосы (парапротеин, М-градиент) в γ- (или β-) зоне — прямой признак клональной пролиферации плазматических клеток (миеломная болезнь, макроглобулинемия Вальденстрёма, моноклональная гаммапатия неясного значения).
• Диагностика острых и хронических воспалений. Характерные изменения: снижение альбумина, повышение α₂-глобулинов (острофазовые белки — гаптоглобин, α₂-макроглобулин), повышение γ-глобулинов (поликлональная активация иммунной системы).
• Оценка функции печени и почек. Снижение альбумина, увеличение α₂- и β-глобулинов (включая трансферрин) и появление преальбумина — признак поражения печени. При нефротическом синдроме наблюдается снижение альбумина, повышение α₂-макроглобулина и β-липопротеинов.
• Мониторинг терапии и ремиссии. При миеломной болезни исчезновение или уменьшение М-градиента говорит об эффективности лечения. При хронических заболеваниях (цирроз печени, системная красная волчанка) нормализация фракций — положительный прогностический признак.

---

Белковые фракции плазмы крови, причины их изменения

При рутинном электрофорезе сыворотки крови (на агарозе, pH 8.6) белки разделяются на следующие фракции (в процентах от общего белка):

| Фракция | Основные белки | Норма, % (от общего белка) |

|---------|----------------|----------------------------|

| Преальбумин | Транстиретин, связывающий тироксин и ретинол | 2–4 % (часто не виден при стандартном электрофорезе) |

| Альбумин | Альбумин (одна фракция) | 55–65 % |

| α₁-глобулины | α₁-антитрипсин, α₁-кислый гликопротеин (орозомукоид), α₁-фетопротеин, сывороточный амилоид A | 2–4 % |

| α₂-глобулины | Гаптоглобин, α₂-макроглобулин, церулоплазмин, эритропоэтин | 6–10 % |

| β-глобулины | Трансферрин, β₂-микроглобулин, гемопексин, C3-комплемент, β-липопротеины (ЛПНП, ЛПОНП) | 8–12 % |

| γ-глобулины | Иммуноглобулины G, A, M, E, D | 12–19 % |

Причины изменения фракций

1. Альбумин

• Снижение (гипоальбуминемия):
• Синтеза (цирроз печени, хронический гепатит, голодание, кахексия).
• Потери (нефротический синдром — массивная протеинурия; ожоги, энтеропатии с потерей белка; кровопотеря).
• Катаболизма (злокачественные опухоли, тиреотоксикоз, лихорадка).
• Разведения (беременность, инфузионная терапия).
• Повышение (гиперальбуминемия):
• Дегидратация (рвота, диарея, ожоги, обезвоживание). Относительное повышение за счёт сгущения крови.

2. α₁-глобулины

• Повышение:
• Острое воспаление (инфекции, травмы, инфаркт) — за счёт повышения α₁-антитрипсина и α₁-кислого гликопротеина (острофазовые белки).
• Беременность (увеличение α₁-фетопротеина).
• Приём эстрогенов.
• Снижение:
• Дефицит α₁-антитрипсина (генетическое заболевание, приводит к эмфиземе лёгких и циррозу печени).

3. α₂-глобулины

• Повышение:
• Острая фаза воспаления (гаптоглобин — образовывает комплекс с гемоглобином, предотвращая его почечное повреждение).
• Нефротический синдром (выраженное повышение α₂-макроглобулина из-за его высокой молекулярной массы и задержки фильтрации).
• Сахарный диабет (повышение гаптоглобина).
• Снижение:
• Гемолиз (гаптоглобин связывается со свободным гемоглобином, комплекс быстро удаляется, фракция падает — важный маркер внутрисосудистого гемолиза).
• Тяжёлая печёночная недостаточность (снижение синтеза всех α₂-глобулинов).
• Болезнь Вильсона—Коновалова (снижение церулоплазмина).

4. β-глобулины

• Повышение:
• Железодефицитная анемия (увеличение трансферрина — компенсаторный синтез).
• Беременность (повышение β-липопротеинов и трансферрина).
• Гиперлипопротеинемии (особенно II типа — повышение ЛПНП).
• Моноцитарная инфильтрация, воспаление (С3-комплемент).
• Снижение:
• Цирроз печени (снижение синтеза комплемента).
• Хронические воспаления (трансферрин снижается как белок отрицательной острой фазы).
• Нефротический синдром (трансферрин теряется с мочой, но β-фракция может быть нормальной или немного снижена).
• Гемохроматоз (трансферрин снижен).
• Дефицит С3-комплемента (аутоиммунные заболевания, мембранозный гломерулонефрит).

5. γ-глобулины

• Поликлональное повышение (диффузное уширение зоны γ-глобулинов):
• Хронические инфекции (туберкулёз, бруцеллёз, вирусные гепатиты, ВИЧ).
• Аутоиммунные заболевания (системная красная волчанка, ревматоидный артрит, аутоиммунный гепатит).
• Саркоидоз, цирроз печени (особенно при хроническом гепатите B или C).
• Моноклональное повышение (узкий пик, М-градиент):
• Множественная миелома IgG, IgA, IgD, IgE (одна из цепей иммуноглобулинов).
• Макроглобулинемия Вальденстрёма (IgM).
• Болезнь лёгких цепей (цепи κ или λ в моче).
• Моноклональная гаммапатия неясного значения (MGUS) — бессимптомное состояние, чаще у пожилых.
• Снижение (гипогаммаглобулинемия):
• Первичные иммунодефициты (агаммаглобулинемия Брутона — X-сцепленная, общий вариабельный иммунодефицит).
• Вторичные — хроническая лимфоцитарная лейкемия, множественная миелома (супрессия нормальных клонов), нефротический синдром (потеря IgG) или значительная кровопотеря.
• Системная красная волчанка (снижение комплемента и иногда IgG).

Изменения фракций редко бывают изолированными. Обычно оценивают сдвиги в комплексе, сопоставляя их с данными клинического анализа крови, общим анализом мочи и специфическими тестами (иммунохимия, определение концентрации отдельных белков).

Все вопросы раздела: подготовка к экзамену по Биохимии