Первичная и высшие структуры белковых молекул. Методы их определения. Понятие о доменах.

Биохимия — ПСБГПМУ, Лечебное дело

Первичная структура белка

Первичная структура – это строго определённая линейная последовательность аминокислотных остатков, соединённых пептидными связями. Каждая аминокислота (за исключением пролина) имеет α‑аминогруппу и α‑карбоксильную группу, которые при образовании пептидной связи теряют молекулу воды:

> [!formula] Пептидная связь

>

> Где и – боковые радикалы. Пептидная связь частично двойная, что делает её жёсткой и плоской (транс-конфигурация).

Последовательность аминокислот кодируется геном (триплетами) и определяет все последующие уровни организации белка.

Методы определения первичной структуры

1. Химическое секвенирование по Эдману (деградация по Эдману)

• Реагент – фенилизотиоцианат (ФИТЦ), который связывается с N-концевым остатком.
• Отщепление N‑концевого остатка в виде фенилтиогидантоина (ФТГ) и его идентификация хроматографией (ВЭЖХ).
• Цикл повторяется, пока возможно детектирование (обычно до 50–70 остатков).
• Недостаток: требуется чистый белок, невозможность длинного прочтения.

2. Масс-спектрометрия (MS)

• Белок гидролизуют или фрагментируют протеазами (например, трипсином) до пептидов.
• Измеряют массу/заряд () фрагментов.
• В тандемной MS‑МС фрагментируют отдельный пептид и по разнице масс определяют последовательность.
• Преимущество: высокая скорость, чувствительность, работа с многокомпонентными смесями.

3. Секвенирование ДНК/РНК (непрямой метод)

• Клонирование гена, определение нуклеотидной последовательности, трансляция по генетическому коду.
• Позволяет предсказать первичную структуру, но не учитывает посттрансляционные модификации.

4. Ферментативное и химическое расщепление + картирование пептидов

• Специфические протеазы (трипсин – после Lys/Arg, химотрипсин – после Tyr/Phe/Trp) дают набор пептидов.
• Разделение и масс-спектрометрический анализ, сборка последовательности.

> [!simple] Простыми словами: первичная структура – это «буквы» (аминокислоты) в строке, которая записана в ДНК. Чтобы её прочесть, либо отрезают по одной букве (Эдман), либо разрезают белок на кусочки и взвешивают (MS), либо читают исходную ДНК.

> [!example] Пример: инсулин состоит из двух цепей (А и B) с известной последовательностью, определённой ещё в 1950‑х методом Эдмана.

---

Высшие структуры белка

Вторичная структура

Регулярное локальное расположение полипептидной цепи, стабилизированное водородными связями между атомами пептидных групп:

• α-спираль – правозакрученная спираль (3,6 аминокислотных остатка на виток). Водородные связи между C=O (i) и N-H (i+4). Радикалы направлены наружу.
• β-складчатый лист – вытянутая зигзагообразная цепь. Участки соединяются водородными связями между параллельными или антипараллельными фрагментами.
• β-поворот (β-turn) – резкая смена направления цепи (4 остатка, водородная связь между i и i+3).
• Неупорядоченная петля (random coil) – нерегулярный участок, часто подвижный.

Третичная структура

Пространственная укладка всей полипептидной цепи в компактную глобулу. Стабилизируется:

• Гидрофобными взаимодействиями (неполярные радикалы внутри глобулы).
• Водородными связями между боковыми цепями.
• Ионными связями (солевые мостики между –COO⁻ и –NH₃⁺).
• Дисульфидными мостиками (–S–S– между остатками цистеина, характерны для внеклеточных белков).
• Вандерваальсовыми силами.

Глобула имеет уникальную форму (топологию). Выделяют несколько архитектур: α/β-цилиндры, β-бочонки, α+β структуры.

Четвертичная структура

Пространственное расположение нескольких полипептидных субъединиц (олигомер). Субъединицы удерживаются теми же нековалентными взаимодействиями (реже дисульфидными мостиками). Примеры: гемоглобин (α₂β₂), иммуноглобулины, ДНК-полимераза.

Методы определения высших структур

1. Рентгеноструктурный анализ (X-ray crystallography)

• Требует кристаллизации белка.
• Рентгеновские лучи дифрагируют на атомах, по картине дифракции восстанавливают электронную плотность.
• Разрешение до 1–2 Å (атомное).
• Недостаток: нужны кристаллы; структура может отличаться от нативной.

2. ЯМР-спектроскопия (NMR)

• Раствор белка в магнитном поле.
• Измерение ядерного эффекта Оверхаузера (NOE) – расстояния между ядрами водорода (< 5 Å).
• Позволяет определить вторичную и третичную структуру небольших белков (< 30–40 кДа) в растворе.
• Недостаток: ограничение по размеру.

3. Криоэлектронная микроскопия (cryo-EM)

• Быстрое замораживание белка, съёмка электронным микроскопом под разными углами.
• Реконструкция трёхмерной карты (среднее разрешение 2–4 Å, у лучших комплексов ~1,5 Å).
• Подходит для больших комплексов, мембранных белков, динамических структур.

4. Круговой дихроизм (CD)

• Измерение разницы поглощения лево- и правополяризованного света.
• Спектры в дальней УФ (200–250 нм) дают информацию о содержании α-спиралей, β-листов, неупорядоченных участков.
• Быстрый метод оценки вторичной структуры (не даёт атомных координат).

5. Флуоресцентная спектроскопия – по положению максимума триптофана судят о полярности микроокружения (индикатор укладки).

6. Вычислительное предсказание (AlphaFold, Rosetta)

• Нейросетевые методы на основе эволюционной информации (MSA).
• Предсказывают координаты атомов с точностью, близкой к экспериментальной.

> [!simple] Простыми словами: чтобы увидеть, как свёрнут белок, используют либо кристаллы и рентген (как фото с очень сильным увеличением), либо магнит (ЯМР) для белков в растворе, либо быстрое замораживание и электронный микроскоп.

> [!example] Пример: структура рибосомы (свыше 50 белков и РНК) определена методом cryo-EM, что привело к Нобелевской премии 2017 года.

---

Понятие о доменах

Домен – компактная, термодинамически стабильная, независимо сворачивающаяся часть полипептидной цепи, часто размером 100–250 аминокислот. Домены представляют собой модули, обладающие собственной функцией или структурной ролью.

Характеристики:

• Домен обычно включает одну вторично-структурную укладку (например, α/β-сэндвич, β-бочка).
• В глобулярных белках один белок может иметь 2–10 доменов.
• Домены могут связывать определённые лиганды (SH2-домен – фосфотирозин), нести каталитический центр (протеазный домен трипсина) или медиировать белок-белковые взаимодействия (PDZ-домен).
• С эволюционной точки зрения домены – «строительные блоки». Комбинирование доменов в разных порядках и комбинациях даёт разнообразие функций (экзонная перетасовка).

Примеры доменов:

• Иммуноглобулиновый домен (Ig-домен) – β-сэндвич из двух β-листов, участвует в иммунном распознавании.
• Домен убиквитина – компактная глобула, участвует в деградации белков.
• ДНК-связывающие домены (Zn-пальцы, гомеодомен) – характерные для транскрипционных факторов.

Домены идентифицируют:

• При анализе трёхмерной структуры (области с высокой плотностью контактов и гидрофобным ядром).
• По выравниванию последовательностей с известными доменами (базы данных Pfam, SMART).
• Предсказательными методами (HMM-профили, нейросети).

> [!critical] Ключевой факт: первичная структура (последовательность аминокислот) кодируется геном и полностью определяет укладку белка в пространстве. Домены – это автономные структурно-функциональные модули, из которых, как из кубиков, собраны сложные многодоменные белки. Методы Эдмана и масс-спектрометрия дают первичную структуру; рентген, ЯМР и криоэлектронная микроскопия – трёхмерную.

---

Итог. Первичная структура – линейная последовательность аминокислот, определяемая генетически и выявляемая методом Эдмана или масс-спектрометрии. Высшие структуры (вторичная, третичная, четвертичная) описывают пространственную организацию белковой молекулы, изучаемую рентгеноструктурным анализом, ЯМР, крио-ЭМ и спектроскопическими методами. Домены – компактные функциональные блоки, являющиеся единицами эволюции и сборки многодоменных белков.

Все вопросы раздела: Подготовка к экзамену по Биохимии