Важнейшие методы современных цито-гистологических исследований.

Гистология — ПСБГПМУ, Лечебное дело

Световая микроскопия и её варианты

Световая микроскопия — базовый метод, основанный на взаимодействии света с исследуемым объектом. Разрешающая способность (минимальное расстояние между двумя точками, которые видны раздельно) ограничена длиной волны света (~0,2 мкм). Для увеличения контраста и выявления невидимых структур применяют специальные методы.

Основные виды световой микроскопии

• Метод светлого поля в проходящем свете. Наиболее распространён. Ткань просвечивается; плотные структуры окрашены сильнее и выглядят тёмными на светлом фоне.
• Фазово-контрастная микроскопия. Используется для изучения живых, неокрашенных клеток. Фазовые изменения световой волны, проходящей через прозрачный объект, преобразуются в амплитудные (яркостные). Позволяет видеть ядро, органеллы в культуре клеток без фиксации.
• Тёмнопольная микроскопия. Основана на эффекте Тиндаля: лучи освещают объект сбоку, в объектив попадает только свет, рассеянный структурами препарата. Объект светится на тёмном фоне. Высокочувствителен для мелких частиц (например, выявление трепонем в мазке).
• Поляризационная микроскопия. Выявляет структуры, обладающие двойным лучепреломлением (анизотропией). В гистологии используется для изучения коллагеновых волокон, миелиновых оболочек нервов, кристаллов солей.
• Люминесцентная (флуоресцентная) микроскопия. Объект облучают светом определённой длины волны, и он испускает свет большей длины волны (флуоресценцию). Разделяют первичную (собственная флуоресценция, например, витаминов) и вторичную (объект обрабатывают флуорохромами).
• Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (КЛСМ). Разновидность флуоресцентной микроскопии с точечным освещением и устранением фонового свечения из внефокусных плоскостей. Позволяет получать серии оптических срезов толстого препарата и строить его трёхмерную реконструкцию. Резко повышает разрешение и контраст.

> [!simple] Простыми словами: Флуоресцентная микроскопия подсвечивает только то, что светится само (или то, что мы покрасили светящимся красителем). Конфокальная микроскопия — это как делать 3D-фотографию клетки срез за срезом, убирая всё лишнее свечение сверху и снизу.

Электронная микроскопия

Метод, в котором вместо света используется пучок электронов, а вместо стёкол — электромагнитные линзы. Разрешающая способность достигает 0,1–0,2 нм, что позволяет изучать ультраструктуру клетки (органеллы, мембраны, рибосомы, вирусы).

Основные виды

• Трансмиссионная (просвечивающая) электронная микроскопия (ТЭМ). Электроны проходят сквозь ультратонкий срез ткани (50–80 нм). Плотные участки (с контрастёрами) сильнее рассеивают электроны и выглядят тёмными. Позволяет изучать внутреннее строение органелл.
• Сканирующая (растровая) электронная микроскопия (СЭМ). Пучок электронов сканирует поверхность объекта. Детектор улавливает отражённые или вторичные электроны. Создаётся трёхмерное изображение поверхности с высоким разрешением. Используется для изучения рельефа клеток.

> [!example] Пример: В ТЭМ можно увидеть слои митохондрии (кристы, матрикс) или период исчерченности коллагенового фибрилла. В СЭМ можно детально рассмотреть поверхность ресничек эпителия трахеи или микроворсинок кишки.

Гистохимические и цитохимические методы

Совокупность методов, позволяющих идентифицировать конкретные химические вещества (белки, липиды, углеводы, нуклеиновые кислоты, ферменты) в сохранившейся структуре ткани.

Основные группы

• Общая гистохимия.
• На белки и аминокислоты: реакция на сульфгидрильные группы (SH-группы), методы выявления гистона (быстрый зелёный, галлоцианин).
• На нуклеиновые кислоты: реакция Фёльгена на ДНК (избирательно докрашивает хроматин), окраска метиловым зелёным-пиронином (ДНК — зелёная, РНК — красная).
• На полисахариды: реакция ШИК (PAS-реакция) — выявляет гликоген, нейтральные гликозаминогликаны (базальные мембраны, слизистый секрет).
• На липиды: красители Судан III, IV, чёрный Судан — окрашивают жировые капли в оранжевый или чёрный цвет (работа на замороженных срезах).
• На ферменты: срезы инкубируют в среде с субстратом и индикатором. Продукт реакции (осадок) локализуется в месте активности фермента (например, щелочная фосфатаза, сукцинатдегидрогеназа).
• Иммуноцитохимия (ИЦХ) и иммуногистохимия (ИГХ). Использует специфические антитела для выявления нужного антигена (белка). Антитело может быть мечено флуорохромом (прямой метод) или ферментом (пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза). Даёт цветную метку в месте нахождения белка.
• Лектиновая гистохимия. Использует лектины (белки, связывающие определённые углеводы). Применяется для картирования рецепторов клеточной поверхности.

> [!simple] Простыми словами: Иммуногистохимия — это поиск конкретного белка-мишени с помощью ключа-антитела, который находит свою мишень и красит её. Это как сыворотка правды для клеток.

Молекулярно-биологические методы на тканевом уровне

Методы, детектирующие нуклеиновые кислоты (ДНК, РНК) непосредственно в гистологическом срезе.

• Гибридизация in situ (FISH, CISH). Меченый зонд (комплементарный участок ДНК или РНК) вносится в срез ткани. Если целевая последовательность присутствует, зонд связывается с ней. Метка (флуорохром — FISH, или хромоген — CISH) видна в ядре или цитоплазме под микроскопом. Используется для выявления генов, мРНК, хромосомных аномалий.
• Полимеразная цепная реакция in situ (in situ PCR, RT-in situ PCR). Усиление (амплификация) сигнала от целевой ДНК/РНК в среде клетки. Крайне чувствительный метод для детекции малого количества вирусной РНК или единичных копий гена.

Методы культуры клеток и тканей

Культивирование in vitro — выделение клеток из организма и поддержание их жизнедеятельности вне его. Необходимо для изучения физиологии, токсичности, дифференцировки.

• Первичные культуры. Клетки, полученные непосредственно из ткани и посеянные в чашку. Имеют короткое время жизни.
• Перевиваемые линии (иммортализованные). Клетки с приобретённой способностью к неограниченному делению (например, HeLa, HepG2). Удобны для стандартизированных экспериментов.
• Культура органов и эксплантов. Сохраняет пространственную архитектуру ткани.

Суправитальное окрашивание — введение красителей (например, нейтрального красного, метиленовой сини) в живые клетки культуры. Позволяет оценить жизнеспособность, фагоцитоз, лизосомы.

Количественные и компьютерные методы

• Морфометрия и стереология.
• Линейная и точечная морфометрия. Подсчёт объектов (клеток, ядер) на единицу площади среза.
• Диаметры, объёмы, толщины. Измерение клеток, волокон, слоёв.
• Стереология. Математическое восстановление 3D-характеристик по 2D-срезам. Позволяет вычислить объёмную плотность, численную плотность, средний объём.
• Денситометрия. Измерение оптической плотности окрашенного продукта. Используется в ИГХ для полуколичественной оценки содержания белка.
• Проточная цитометрия. Клетки в суспензии пролетают в потоке через лазерный луч. По рассеиванию света и флуоресценции анализируются тысячи клеток в секунду. Позволяет определить размер, гранулярность, экспрессию поверхностных и внутриклеточных антигенов, а также сортировать клетки.
• Компьютерная (цифровая) морфометрия. Анализ изображений с помощью программ (ImageJ, CellProfiler). Автоматизированный подсчёт ядер, детекция сосудов, измерение площади некроза.

> [!critical] Ключевой факт: Основой всех методов является адекватная фиксация (предотвращает аутолиз и сохраняет структуру). Для гистохимии критична сохранность не только структуры, но и химической природы вещества. Для молекулярных методов (ИГХ, FISH) — сохранность антигенной детерминанты и нуклеиновых кислот.

---

Итог. Современная цито-гистология — это не только классическая световая микроскопия (светлое поле, фазовый контраст, поляризация), но и мощные инструменты: электронная микроскопия (ультраструктура), иммуногистохимия (белки-мишени), FISH (гены) и проточная цитометрия (количественный фенотип клеток). Выбор метода диктуется задачей: изучить живой процесс, найти конкретный белок, выявить генетическую аномалию или получить трёхмерную модель ткани. Без адекватной пробоподготовки (фиксация, резка) все последующие методы бессмысленны.

Все вопросы раздела: Подготовка к экзамену по Гистологии