Биология — СЗГМУ, Лечебное дело
Гистоавторадиография — это метод выявления локализации радиоактивно меченых веществ в гистологических срезах и других биологических объектах, основанный на регистрации излучения от этих веществ с помощью фотоэмульсии.
Биологическому объекту вводят вещество, меченное радиоактивным изотопом (например, <sup>3</sup>H-тимидин для ДНК, <sup>35</sup>S-метионин для белка, <sup>125</sup>I для гормонов). После фиксации и приготовления гистологического среза на него наносят слой ядерной фотоэмульсии, содержащей кристаллы галогенида серебра (AgBr). При распаде радиоактивного изотопа испускаются частицы (β-частицы, γ-кванты), которые, проходя через эмульсию, ионизируют кристаллы AgBr. После проявления эмульсии восстановленные атомы серебра формируют черные зерна (треки) в местах, где находился источник излучения. Эти зерна визуализируют распределение радиоактивного соединения в ткани.
1. Введение метки: животному (in vivo) или культуре клеток (in vitro) добавляют радиоактивно меченый предшественник.
2. Фиксация и приготовление срезов: объект фиксируют (обычно химически), заливают в парафин или смолу, режут на микротоме (толщина 3–10 мкм). Для высокого разрешения используют полутонкие и ультратонкие срезы.
3. Нанесение эмульсии: в темноте срез покрывают расплавленной ядерной фотоэмульсией (метод погружения или аппликации). Эмульсию высушивают.
4. Экспозиция: препарат выдерживают в темноте при 4°C от нескольких дней до месяцев (в зависимости от активности изотопа и типа излучения). За это время частицы от распада создают скрытое изображение.
5. Проявление и фиксация: стандартные фотопроцессы: проявитель восстанавливает AgBr до металлического серебра, фиксаж удаляет непроявленные кристаллы.
6. Окраска (необязательно): срез можно дополнительно окрасить гистологическими красителями (гематоксилин-эозин) для идентификации структур.
7. Анализ: подсчет зерен серебра в различных зонах среза с помощью светового или электронного микроскопа.
+ Высокая информативность о метаболизме и транспорте в целостной ткани.
+ Возможность количественного анализа (число зерен коррелирует с количеством радиоактивного вещества).
Электронная микроскопия — это совокупность методов визуализации биологических объектов с использованием пучка ускоренных электронов вместо света. Электроны имеют длину волны в тысячи раз короче, чем видимый свет (при ускоряющем напряжении 100 кВ λ ~ 0,0037 нм), что позволяет достичь разрешения до 0,1–0,2 нм (в сотни тысяч раз выше, чем у светового микроскопа).
Электроны испускаются из катода (вольфрамовая нить, гексаборид лантана или полевой эмиттер), ускоряются в электрическом поле и фокусируются магнитными линзами (конденсорные, объективная, проекционная). Взаимодействие электронов с образцом приводит к рассеянию, поглощению, вторичной эмиссии. Изображение формируется из электронов, которые прошли сквозь образец (просвечивающая микроскопия, ПЭМ / TEM) или отразились от поверхности (сканирующая микроскопия, СЭМ / SEM). Вся колонна находится под вакуумом (10<sup>-4</sup>–10<sup>-7</sup> Па) для предотвращения рассеяния электронов молекулами газа.
1. Фиксация (глутаральдегид + четырехокись осмия для сохранения ультраструктуры и контраста).
2. Обезвоживание и заливка в эпоксидную смолу.
3. Ультрамикротомия (алмазным ножом получают срезы 50–100 нм).
4. Контрастирование солями тяжелых металлов (уранилацетат, цитрат свинца) для увеличения контраста мембран, рибосом, филаментов.
5. Нанесение среза на медную сетку.
1. Фиксация (глутаральдегид, четырехокись осмия).
2. Обезвоживание (спирты, ацетон).
3. Высушивание (критической точкой CO₂ — для предотвращения деформации).
4. Напыление токопроводящего слоя (золото, платина, углерод) для снятия заряда и повышения вторичной эмиссии.
| Параметр | Световая микроскопия | Электронная микроскопия |
|----------|----------------------|--------------------------|
| Источник излучения | Видимый свет (λ 400–700 нм) | Пучок электронов (λ 0,0037 нм при 100 кВ) |
| Разрешение | ~200 нм (максимум) | ~0,2 нм (ПЭМ), ~1–10 нм (СЭМ) |
| Увеличение | до 1500–2000x | до 1 000 000x (ПЭМ), до 500 000x (СЭМ) |
| Изображение | Цветное (при окраске) | Монохромное (полутоновое) |
| Живые объекты | Возможно | Невозможно (вакуум, фиксация) |
| Толщина образца | до десятков мкм | 50–100 нм (ПЭМ), объёмные образцы (СЭМ) |
| Подготовка | Фиксация, окраска, заливка (быстро) | Многоступенчатая, длительная (фиксация, обезвоживание, заливка, ультрамикротомия, контрастирование, напыление) |
Таким образом, гистоавторадиография и электронная микроскопия являются взаимодополняющими методами: первая позволяет проследить функциональную активность (метаболизм, синтез, связывание), вторая — детально визуализировать структурную организацию на ультраструктурном уровне.