Способы изготовления гистологических препаратов. Критерии выбора способа, этапы.

Патологическая анатомия — СЗГМУ, Лечебное дело

Способы изготовления гистологических препаратов. Критерии выбора способа, этапы.

Цель изготовления гистологического препарата — получить тонкий, прозрачный срез ткани, пригодный для исследования в проходящем свете (световая микроскопия) или в вакууме (электронная микроскопия), на котором сохранена структура, близкая к прижизненной.

Основные способы изготовления гистологических препаратов

Методы различаются по способу фиксации и обработки ткани, типу среды, в которую заключается материал, и цели исследования. Выделяют два принципиальных подхода:

1. Световая микроскопия (основной метод в патологической анатомии):

• Парафиновая заливка (классический метод): Материал обезвоживают, пропитывают парафином и режут на микротоме. Позволяет получать серийные срезы толщиной 4–10 мкм.
• Заморозка (криостатный метод): Замороженный материал режут в криостате (микротоме с охлаждением). Толщина срезов 5–15 мкм. Используется для срочных интраоперационных биопсий (экспресс-диагностика) и для выявления жиров, ферментов (гистохимия).
• Заливка в целлоидин: Медленный метод для изучения плотных тканей (кости, зубы) или крупных объектов. Требует длительной проводки и специального микротома (срезы 20–200 мкм). Сейчас используется редко.
• Полутонкие срезы (эпоксидная смола): Материал заливают в эпоксидные смолы, получают срезы толщиной 0,5–2 мкм на ультрамикротоме. Используют для световой микроскопии после контрастирования. Обеспечивает высокую детализацию, промежуточный этап перед электронной микроскопией.
• Метод отпечатков (мазков): Для цитологического исследования (например, соскоб с шейки матки, пунктат). Фиксация — спиртом или ацетоном.

2. Электронная микроскопия (трансмиссионная, ТЭМ):

• Заливка в эпоксидные смолы (например, аралдит, эпон): Материал фиксируют глутаровым альдегидом и осмием, обезвоживают, пропитывают смолой и полимеризуют. Режут на ультрамикротоме алмазным ножом (толщина 30-100 нм). Контрастируют уранилацетатом и цитратом свинца.

Критерии выбора способа

Выбор метода определяется тремя группами факторов:

| Критерий | Предпочтительный метод | Комментарий |

| :--- | :--- | :--- |

| Цель исследования | | |

| * Рутинная диагностика (опухоли, воспаление) | Парафиновая заливка (позволяет проводить иммуногистохимию). | Стандарт, хорошая обзорность, специфичные окраски. |

| * Срочная диагностика (интраоперационная биопсия) | Заморозка (криостат). | Скорость (10-20 минут), но ниже качество, артефакты кристаллами льда. |

| * Выявление липидов, жировой дистрофии | Заморозка + окраска Суданом (или Oil Red O). | Парафин растворяет жиры. |

| * Иммуногистохимия (ИГХ) | Парафин или заморозка (при необходимости сохранить нативные антигены). Парафин — предпочтительно для многих антител после теплового демаскирования. | Некоторые антигены разрушаются парафином (тогда нужна заморозка). |

| * Ультраструктурный анализ | Электронная микроскопия (ТЭМ) + эпоксидные смолы. | Для исследования органелл, включений вирусов, базальных мембран. |

| * Гистохимия ферментов | Заморозка (ферменты инактивируются фиксаторами). | Крайне важна быстрая заморозка в жидком азоте (-196°C). |

| Тип объекта | | |

| * Мягкие ткани (печень, лёгкое) | Любой метод. | Стандарт — парафин. |

| * Плотные ткани (кость, зубы) | Сначала декальцинация (кислота или ЭДТА), затем парафин. Или — целлоидин (для очень плотных). | Без декальцинации нож микротома разрушается. |

| * Мелкие объекты (биоптаты иглой) | Специальная маркировка (агар, желатин), заливка в парафин или эпоксидную смолу. | Важно не потерять материал. |

| Необходимая скорость | | |

| * Минуты | Заморозка (криостат). | Для решения вопроса о радикальности операции. |

| * Часы-дни | Парафиновая заливка (стандартная проводка 20-24 ч). | Золотой стандарт. |

| * Недели | Целлоидин, некоторые методы гистохимии. | Длительное обезвоживание и пропитка. |

Этапы изготовления гистологического препарата (на примере парафиновой заливки)

Этапы являются универсальными, за исключением специфических процедур (декальцинация, заморозка).

1. Взятие материала (биопсия)

• Кусочки ткани размером не более 1,0 × 1,0 × 0,5 см (не более 1 см³).
• Острым инструментом (скальпелем) для минимизации артефактов сдавления.
• Немедленно помещают в фиксатор (10% нейтральный формалин — универсальный для рутинной диагностики). Соотношение объёмов фиксатор:ткань = 10:1.
• Важно: Крупные куски (например, вся матка, желудок) фиксируют целиком, но режут после фиксации.

2. Фиксация

• Цель: Остановить автолиз и гниение, сохранить структуру белков и нуклеиновых кислот.
• Механизм: Формалин (формальдегид) сшивает белки, образуя метиленовые мостики.
• Продолжительность: 24-48 часов при комнатной температуре.
• Альтернативы: Глутаровый альдегид (для ЭМ), спирт (для цитологии), фиксаторы на основе пикриновой кислоты (Буэн, Ценкер).

3. Проводка (обезвоживание и просветление)

• Цель: Удалить из ткани воду и пропитать её растворителем парафина (ксилолом, толуолом).
• Этапы (автоматический гистопроцессор):

1. Обезвоживание в спиртах возрастающей концентрации (70% → 80% → 96% → 100% спирт). Вода вытесняется спиртом.

2. Просветление в ксилоле (или толуоле, бензоле). Спирт вытесняется ксилолом, ткань становится прозрачной (преломление света).

3. Пропитка парафином (при 56-58°C). Ксилол замещается горячим расплавленным парафином (обычно 2-3 смены).

• Общее время: 18-24 часа (для стандартных кусков 0,5 см).

4. Заливка (Заключение в парафин)

• Цель: Создать твердый блок, из которого можно сделать тонкие срезы.
• Выполнение: Ткань помещают в заливочную форму (кассету), заливают расплавленным парафином и дают остыть (кристаллизоваться) на холодной плите (+4°C). Форму снимают, оставляя парафиновый блок.

5. Резка (микротомия)

• Инструмент: Микротом (санный, ротационный). Лезвие — одноразовые стальные ножи (типа C-35, MX35).
• Толщина срезов: 4-10 мкм (стандарт для окраски гематоксилин-эозином — 4-5 мкм).
• Техника: Блок закрепляют в микротоме. Вращающимся движением срезают «ленту» срезов, которую затем расправляют в ванне с теплой водой (+37...40°C). Срез помещают на предметное стекло (обычное или адгезивное).

6. Окрашивание

• Цель: Придать структурам ткани контраст для визуализации.
• Основные методы:

1. Гематоксилин и эозин (ГЭ) — «золотой стандарт»:

• Гематоксилин (основной краситель) — окрашивает ядра в сине-фиолетовый цвет (базофильно) — ДНК, РНК.
• Эозин (кислый краситель) — окрашивает цитоплазму и внеклеточный матрикс в розовый/красный цвет (эозинофильно) — белки, коллаген.

2. Специальные методы (для выявления конкретных компонентов):

• Ван Гизон (пикрофуксин) — соединительная ткань (коллаген) красная, мышцы жёлтые.
• Масон (трихром) — коллаген синий/зелёный, мышцы красные.
• Ретикулин (по Гомори) — ретикулиновые волокна чёрные на сером фоне.
• Конго красный — амилоид красно-коричневый (с зеленым свечением в поляризованном свете).
• Перлс (реакция на железо) — гемосидерин (железо) окрашивается в синий цвет.

3. Иммуногистохимия (ИГХ): Использование антител к специфическим антигенам (например, к рецепторам рака молочной железы, к Ki-67). Визуализация с помощью систем детекции (DAB — даёт коричневое окрашивание, красный хромоген).

7. Заключение (покрытие покровным стеклом)

• Цель: Сохранить препарат на длительное время, обеспечить оптическую однородность (равный показатель преломления средой).
• Выполнение: На предметное стекло со срезом наносят тонкий слой заключающей среды (например, канадский бальзам, DPX, Cytoseal) и сверху накрывают покровным стеклом, стараясь не допустить пузырьков воздуха.
• Сушка: 24-48 часов при комнатной температуре (или в термостате при +37°C).

Дополнительные этапы для специальных методов

• Для заморозки (криостат):

1. Кусочек ткани (0,5 × 0,5 см) помещают на замораживающий столик криостата.

2. Быстро замораживают (обычно с помощью жидкого азота или охлажденной плиты).

3. Режут на криостате при -15...-25°C.

4. Срез переносят на стекло и фиксируют (обычно в 96% спирте или ацетоне) 1-2 минуты.

5. Окрашивают (ГЭ или быстрая окраска — толуидиновый синий).

6. Заключают.

• Для электронной микроскопии:

1. Фиксация глутаровым альдегидом (1–4%) + постфиксация осмием (1–2%) — сохраняет мембраны.

2. Обезвоживание через спирты и ацетон.

3. Пропитка эпоксидной смолой (полимеризуется при 60°C 12-48 ч).

4. Резка на ультрамикротоме (стеклянный или алмазный нож) — срезы толщиной 30–100 нм.

5. Окрашивание (контрастирование) — уранилацетат (двойные связи) + цитрат свинца (белки, мембраны).

6. Монтаж на сетки (медные/никелевые).

Артефакты при изготовлении препарата

Важно понимать, что любой метод модифицирует ткань. Основные артефакты:

• Усадка (сжатие) ткани: Нормальный процесс, особенно при парафиновой проводке (10-15%).
• Кристаллы льда (при заморозке): Разрывают клетки, создают "сотовый" рисунок.
• Складки и разрывы среза: Ошибки микротомии (тупой нож, неправильная температура блока).
• Теневые артефакты (при окраске): Неравномерное пропитывание парафином или красителем.
• Денатурация антигенов (при ИГХ): Использование сильных фиксаторов или длительной тепловой обработки.

Все вопросы раздела: подготовка к экзамену по Патологической анатомии