Биохимия — ИГМА, Лечебное дело
Молекулярная масса (Mr) белков варьирует в широких пределах — от нескольких тысяч (например, инсулин — около 5,7 кДа) до миллионов дальтон (например, белки соединительной ткани или вирусные капсиды). Белки являются макромолекулами, их масса на несколько порядков превышает массу неорганических соединений.
> [!simple] Простыми словами: Белки — это очень большие молекулы, вес которых измеряется в десятках и сотнях тысяч атомных единиц. Для сравнения: молекула воды весит 18 Да, а молекула гемоглобина — около 64 500 Да.
По форме молекулы белки делят на две группы:
Глобулярные и фибриллярные белки
> [!example] Пример: Гемоглобин — типичный глобулярный белок, коллаген — фибриллярный (спирализованные тройные цепи).
Форма белка определяется последовательностью аминокислот и условиями среды. От формы зависят биологическая активность, взаимодействие с лигандами, способность к агрегации.
Изоэлектрическая точка — значение pH, при котором суммарный заряд молекулы белка равен нулю. В ИЭТ белок электронейтрален.
> [!formula] Расчёт приблизительного pI
> Для белка с известным составом pI = (pKa наиболее кислой из основных групп + pKa наиболее основной из кислых групп) / 2.
> Однако на практике pI определяют экспериментально методами изоэлектрофокусирования.
> [!simple] Простыми словами: ИЭТ — это кислотность раствора, при которой белок «нейтрален» (его положительные и отрицательные заряды уравновешены). В такой среде он хуже всего растворяется.
Растворимость белка — способность образовывать гомогенную систему с растворителем (обычно водой). Факторы, влияющие на растворимость:
1. Природа белка: глобулярные белки с гидрофильной поверхностью (альбумины) хорошо растворимы; фибриллярные и мембранные — плохо или нерастворимы.
2. pH: в ИЭТ растворимость минимальна.
3. Ионная сила раствора: малые концентрации солей (до 0,15 М) повышают растворимость (явление солевого растворения); высокие концентрации солей (сульфат аммония, хлорид натрия) вызывают высаливание (обратимую преципитацию).
4. Температура: для большинства белков растворимость возрастает с температурой до определённого предела (затем денатурация).
5. Наличие органических растворителей:
> [!simple] Простыми словами: Белки растворяются в воде благодаря зарядам на поверхности. Если убрать заряды (например, изменить pH или добавить много соли), белок «слипается» и выпадает в осадок.
Денатурация — нарушение нативной (природной) пространственной структуры белка (вторичной, третичной, четвертичной) без разрыва ковалентных пептидных связей. Она приводит к потере биологической активности, изменению физико-химических свойств (растворимости, вязкости, электрофоретической подвижности).
Основные денатурирующие факторы:
| Фактор | Механизм действия |
|--------|------------------|
| Высокая температура | Разрыв водородных связей, гидрофобных взаимодействий |
| Экстремальные pH | Ионизация групп, разрушение ионных связей |
| Органические растворители | Нарушение гидрофобных взаимодействий |
| Детергенты (SDS) | Разрыв гидрофобных и ионных связей |
| Тяжёлые металлы (Hg²⁺, Pb²⁺) | Связывание сульфгидрильных групп |
| Механическое воздействие (взбалтывание, ультразвук) | Разрыв слабых связей |
Денатурация белка
> [!critical] Ключевой факт: Денатурация — это разрушение пространственной структуры, но не первичной последовательности аминокислот. Потеря функции происходит именно из-за нарушения укладки цепи.
Высаливание — осаждение белка из водного раствора при добавлении высокой концентрации нейтральных солей (сульфата аммония, хлорида натрия, сульфата натрия). Механизм: ионы соли конкурируют с молекулами воды за гидратную оболочку белка, лишая белок гидратации, что приводит к агрегации и преципитации.
> [!example] Пример: В клинической лаборатории для осаждения глобулинов из сыворотки крови добавляют сульфат аммония до 50% насыщения, осадок отделяют центрифугированием; альбумины остаются в надосадке.
Диализ — метод разделения макромолекул (белков) и низкомолекулярных примесей (солей, буферов, метаболитов) с помощью полупроницаемой мембраны. Мембрана (целлофан, ацетатцеллюлоза) пропускает молекулы меньше определённого размера (например, < 10 кДа), но задерживает белки.
Диализ
> [!simple] Простыми словами: Это процесс, в котором белки остаются в «мешочке», а маленькие молекулы (соль, сахар) выходят наружу, потому что мембрана работает как сито с очень мелкими дырками.
Гидролиз белков — расщепление пептидных связей до аминокислот (или полипептидов) под действием воды. Различают:
> [!example] Пример: Для определения аминокислотного состава белка образец гидролизуют в 6 М HCl при 110 °C 24 ч, затем аминокислоты разделяют методом ионообменной хроматографии с нингидриновым детектированием.
Электрофорез — метод разделения белков (и других заряженных молекул) в электрическом поле, основанный на различии их электрофоретической подвижности. Скорость движения зависит от:
1. Суммарного заряда молекулы (определяется pH буфера).
2. Размера и формы молекулы (трение о среду).
3. Напряжённости электрического поля.
4. Вязкости и состава носителя (агароза, полиакриламидный гель).
Основные виды:
Электрофорез белков
> [!critical] Ключевой факт: Электрофорез в денатурирующих условиях (SDS-PAGE) разделяет белки исключительно по молекулярной массе, так как SDS разрушает пространственную структуру и придаёт всем белкам одинаковое отношение заряд/масса. Нативный электрофорез сохраняет конформацию и учитывает заряд и размер.
---
> [!critical] Ключевой факт: Знание физико-химических свойств белков (молекулярная масса, заряд, ИЭТ, растворимость) лежит в основе методов их выделения (высаливание, диализ), очистки (хроматография, электрофорез) и анализа (гидролиз, секвенирование). Денатурация — обратимый или необратимый процесс, который необходимо учитывать при работе с белками.
---
Итог. Физико-химические свойства белков (масса, форма, ИЭТ, растворимость, чувствительность к денатурации) определяют выбор методов их исследования: высаливание и диализ используются для очистки, гидролиз — для анализа состава, электрофорез — для разделения и идентификации. Каждый метод имеет строгое теоретическое обоснование и широкое практическое применение в биохимии, медицине и биотехнологии.