Сущность методов люминисцентной микроскопии и культивирования клеток.

Биология — СЗГМУ, Лечебное дело

Сущность методов люминесцентной микроскопии и культивирования клеток

Люминесцентная микроскопия

Физико-химическая основа метода

Люминесцентная микроскопия — группа методов световой микроскопии, основанных на явлении люминесценции — испускании фотонов веществом после перехода электронов из возбуждённого состояния в основное. Возбуждение осуществляется преимущественно ультрафиолетовым (УФ) или синим светом (длина волны 300–500 нм). Испускаемый свет всегда имеет большую длину волны (меньшую энергию), чем возбуждающий, за счёт потерь на колебательную релаксацию (правило Стокса).

Различают два основных типа люминесценции:

• Флуоресценция — свечение, прекращающееся практически мгновенно (10⁻⁹ – 10⁻⁶ с) после прекращения возбуждения.
• Фосфоресценция — длительное послесвечение (до нескольких секунд и более) из-за метастабильных триплетных состояний; в биомедицинских исследованиях применяется редко.

Для наблюдения требуется специальный микроскоп, оснащённый:

• источником света высокой интенсивности (ртутная или ксеноновая лампа, лазер);
• возбуждающим светофильтром, выделяющим полосу длин волн для активации флуорохрома;
• дихроичным зеркалом, направляющим возбуждающий свет на образец и пропускающим испускаемый к детектору;
• запирающим (эмиссионным) светофильтром, блокирующим возбуждающий свет и пропускающим только флуоресценцию.

Основные типы люминесцентной микроскопии

• Прямая (классическая) флуоресцентная микроскопия — образец освещается широким полем; флуоресценция регистрируется одновременно со всего поля зрения.
• Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия — точечное лазерное возбуждение и пространственная фильтрация через конфокальную диафрагму (пинхол). Позволяет получать оптические срезы и 3D-реконструкции с высоким разрешением.
• Многофотонная микроскопия — возбуждение флуорохрома двумя или тремя фотонами инфракрасного диапазона в фокальной плоскости. Обеспечивает глубокое проникновение в ткани (до 1 мм) и минимальное фототоксическое действие.
• Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения (TIRF) — возбуждается эванесцентное поле, проникающее лишь на ~100–200 нм от поверхности стекла; используется для изучения мембранных процессов.

Методы специфического окрашивания

• Прямая иммунофлуоресценция — антитела, конъюгированные с флуорохромом (FITC, TRITC, AlexaFluor), связываются с антигеном непосредственно в ткани или клетке.
• Непрямая иммунофлуоресценция — сначала на антиген наносятся немеченые первичные антитела, затем — вторичные антитела, меченные флуорохромом и направленные против Fc-фрагмента первичных. Обеспечивает усиление сигнала.
• Флуоресцентные белки — генетически кодируемые маркеры (GFP, YFP, mCherry). Ген белка встраивается в геном клетки под промотор, что позволяет визуализировать живые клетки и динамику экспрессии.
• Флуоресцентные красители — низкомолекулярные соединения селективно накапливаются в органеллах (DAPI — ядро, MitoTracker — митохондрии, фаллоидин — F-актин).
• Аутофлуоресценция — собственное свечение тканей (липофусцин, эластин, коллаген). В большинстве случаев считается помехой, но может использоваться для диагностики (например, порфиринов).

Применение в биологии и медицине

• Иммуноцитохимия и иммуногистохимия — локaлизация конкретных белков, рецепторов, антигенов в клетках и срезах.
• Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) — детекция хромосомных аномалий и локализация генов с помощью меченых ДНК-зондов.
• Анализ клеточного цикла и апоптоза — окрашивание ДНК (пропидий йодид, Hoechst) с измерением плоидности и суб-G1 пика.
• Прижизненная микроскопия — наблюдение за живыми клетками в режиме реального времени (time-lapse, FRAP, FRET).
• Диагностика — выявление аутоантител (при системной красной волчанке — АНА-тест), определение рецепторов HER2, визуализация микобактерий (аурамин-родамин).

Культивирование клеток

Определение и задачи метода

Культивирование клеток — комплекс приёмов, обеспечивающих рост, размножение и поддержание жизнеспособности клеток in vitro вне организма. Основные цели:

• изучение клеточной физиологии, метаболизма, сигнальных путей;
• моделирование патологических процессов (рак, инфекции, генетические заболевания);
• скрининг и тестирование фармакологических препаратов;
• получение биопродуктов (моноклональные антитела, вакцины, факторы роста);
• клеточная терапия и регенеративная медицина.

Типы клеточных культур

• Первичные культуры — клетки, выделенные непосредственно из ткани путём ферментативного (трипсин, коллагеназа) или механического разобщения. Гетерогенны, имеют ограниченный срок жизни (обычно 10–50 делений) — феномен Хейфлика.
• Перевиваемые (иммортализованные) линии — клетки, способные к неограниченному делению в результате спонтанной трансформации (например, HeLa) или искусственной иммортализации (введение вирусных онкогенов, hTERT). Эти клетки часто имеют анеуплоидный кариотип.
• Суспензионные культуры — клетки растут во взвешенном состоянии (лимфоидные, некоторые лейкозные). Не требуют твёрдого субстрата.
• Адгезивные (монослойные) культуры — клетки прикрепляются к поверхности культурального пластика, образуя монослой (эпителиальные, фибробласты, эндотелиальные).
• Трёхмерные (3D) культуры — сфероиды, органоиды, клетки в матриксе (Matrigel, гидрогели). Более точно воспроизводят тканевую архитектуру и микроокружение.

Условия культивирования

• Стерильность — основное требование. Работу проводят в ламинарном боксе (класс II), используют автоклавированную посуду, стерильные растворы, антибиотики (пенициллин-стрептомицин). Регулярная проверка на контаминацию микоплазмами, грибами.
• Питательная среда — базовый состав (среда MEM, DMEM, RPMI-1640) обеспечивает ионы, аминокислоты, глюкозу, буферы. Дополнительно вносят сыворотку эмбрионов коров (FBS, 5–20%) или синтетические заменители (факторы роста, гормоны, инсулин, трансферрин).
• Газовый состав и pH — поддерживается в CO₂-инкубаторе (5–7% CO₂, 95% влажность). CO₂ образует угольную кислоту в среде, стабилизируя pH в диапазоне 7.2–7.4. Индикатор феноловый красный визуально контролирует pH: жёлтый — ацидоз, розовый — алкалоз, оранжевый — норма.
• Температура — 37°C ± 0.5°C.
• Субстрат — для адгезивных клеток: заряженный полистирол (TCPS — tissue culture polystyrene), стекло; при необходимости покрывают коллагеном, полилизином, фибронектином.

Этапы работы с культурами

• Получение клеток — из донорской ткани (биопсия, аутопсия) или из коммерческих коллекций (ATCC, ECACC). Ткань измельчают, инкубируют с растворами ферментов (коллагеназа, трипсин/ЭДТА), центрифугируют, ресуспендируют в среде.
• Посев — клетки подсчитывают в камере Горяева или с помощью автоматического счётчика (Coulter Counter). Плотность посева обычно 5×10³ – 10⁴ клеток/см². Критерий качества — жизнеспособность не ниже 90% (тест с трипановым синим: живые клетки исключают краситель).
• Пассирование (субкультивирование) — пересев клеток при достижении конфлюэнтности (плотного монослоя, 80–90% поверхности). Удаляют среду, промывают ЭДТА, добавляют трипсин/ЭДТА на 2–5 мин, отмывают средой с сывороткой (инактиватор трипсина), ресуспендируют и рассевают на новые флаконы.
• Криоконсервация — клетки замораживают на стадии логарифмического роста в среде с 10% ДМСО (диметилсульфоксид) или глицерина (криопротекторы). Хранят в жидком азоте (−196°C). Для размораживания — быстрый нагрев на водяной бане 37°C.

Применение в биологии и медицине

• Токсикология и фармакология — определение цитотоксичности (МТТ-тест, лактатдегидрогеназа), оценка IC50, изучение метаболизма лекарств.
• Вирусология — выделение и титрование вирусов (бляшкообразование, ЦПД), производство вакцин (полиомиелит, грипп, корь).
• Канцерогенез — исследование трансформации, генетической нестабильности, роли онкогенов и супрессоров.
• Стволовые клетки — изучение плюрипотентности (ЭСК, iPS), направленная дифференцировка, моделирование наследственных заболеваний.
• Биотехнология — производство терапевтических белков (эритропоэтин, интерфероны, моноклональные антитела — рекомбинантные линии CHO, HEK293).
• Персонализированная медицина — тестирование индивидуальной чувствительности опухолевых клеток пациента к химиопрепаратам с помощью органоидов.

Все вопросы раздела: подготовка к экзамену по Биологии