Микробиология — ИГМА, Лечебное дело
Различают три основные морфологические группы бактерий:
Шаровидные (кокки)
Палочковидные (бациллы)
Извитые формы
Основные формы бактерий
Единица измерения — микрометр (мкм, 1 мкм = 10⁻³ мм). Для разрешения светового микроскопа достаточно объектов размером >0,2 мкм.
> [!simple] Простыми словами: Бактерии — это одноклеточные организмы размером в несколько тысячных долей миллиметра. Они бывают трёх основных форм: шарики (кокки), палочки (бациллы) и завитки (спириллы, спирохеты). Расположение клеток после деления (цепочка, гроздь, пара) — важный признак для идентификации.
Определяется плоскостями деления и характером сцепления клеток после деления. У палочковидных форм различают:
Тинкториальные свойства — способность бактерий воспринимать красители и окрашиваться определённым образом, обусловленная физико-химическими особенностями клеточной стенки, цитоплазмы, нуклеоида, включений.
1. Химический состав клеточной стенки — соотношение пептидогликана, полисахаридов, липидов, тейхоевых кислот.
2. Структура цитоплазматической мембраны — проницаемость для красителей.
3. Электрический заряд поверхности клетки — определяет сродство к основным и кислотным красителям.
4. Наличие капсулы, спор, жгутиков — изменяет доступ красителя.
5. Физиологическое состояние клетки — молодые и старые клетки окрашиваются иначе (например, старые грамположительные клетки могут терять способность удерживать комплекс кристаллического фиолетового с йодом).
| Группа | Характеристика | Примеры родов |
|---|---|---|
| Грамположительные | Удерживают комплекс кристаллического фиолетового с йодом; окрашиваются в сине-фиолетовый цвет | Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Corynebacterium, Clostridium |
| Грамотрицательные | Не удерживают комплекс; обесцвечиваются спиртом; окрашиваются дополнительным красителем (фуксин) в красный цвет | Escherichia, Salmonella, Shigella, Neisseria, Pseudomonas |
| Кислотоустойчивые | Клеточная стенка содержит высокое содержание миколовых кислот; устойчивы к обесцвечиванию кислым спиртом; окрашиваются основными красителями при нагревании | Mycobacterium, Nocardia |
| Метахроматические | Содержат зерна волютина (полифосфаты), которые при окраске основными красителями приобретают другой оттенок (красно-фиолетовый на синем фоне) | Corynebacterium |
| Неокрашивающиеся | Имеют малое сродство к красителям из-за высокой гидрофобности или особенностей капсулы | Bifidobacterium (некоторые штаммы), капсульные формы (Klebsiella) |
> [!simple] Простыми словами: Тинкториальные свойства — это то, как бактерии «относятся» к красителям. Некоторые прочно удерживают краску (как грамположительные), другие легко её отдают при промывке спиртом (грамотрицательные). Кислотоустойчивые бактерии (возбудители туберкулёза, проказы) вообще очень трудно окрасить и ещё труднее обесцветить — из-за воскоподобной оболочки.
По количеству применяемых красителей:
По цели исследования:
Используют один краситель (основной или кислотный). Основные красители (метиленовый синий, кристаллический фиолетовый, фуксин) связываются с отрицательно заряженными компонентами клетки (нуклеиновые кислоты, полисахариды). Кислотные красители (эозин, фуксин кислый) окрашивают среду, а клетка остаётся неокрашенной — негативное контрастирование.
Техника простой окраски:
1. Фиксированный мазок заливают красителем (1–5 мин).
2. Промывают водой.
3. Высушивают, микроскопируют.
Пример: Окраска метиленовым синим по Лёффлеру (1–2 мин) — клетки окрашиваются интенсивно синим, включения — слабее.
Наиболее распространённый дифференцирующий метод, разделяющий бактерии на две группы (грамположительные и грамотрицательные) на основе различий в строении клеточной стенки.
Этапы метода:
1. Основная окраска — кристаллический фиолетовый (1 мин). Все клетки окрашиваются в сине-фиолетовый.
2. Фиксация красителя — раствор Люголя (йод + калий йодид) (1 мин). Образуется комплекс кристаллический фиолетовый–йод (КФ-йод), фиксирующийся в клетке.
3. Дифференцировка — 96% этанол (30 с – 1 мин). Грамотрицательные клетки обесцвечиваются, грамположительные остаются окрашенными.
4. Дополнительная окраска — фуксин Пфейффера (или сафранин) (30 с – 1 мин). Грамотрицательные клетки приобретают красный/розовый цвет.
Механизм дифференцировки:
Результат:
Окраска по Граму
> [!example] Пример: При окраске мазка из гноя стафилококки выглядят как фиолетовые гроздья (Гр⁺ кокки), а кишечная палочка — как красные палочки (Гр⁻ палочки).
Принцип: Кислотоустойчивые бактерии (микобактерии) содержат в клеточной стенке миколовые кислоты (длинные жирные кислоты C60–C90), которые при нагревании прочно связываются с карболовым фуксином и не обесцвечиваются кислым спиртом.
Этапы:
1. На фиксированный мазок накладывают фильтровальную бумагу, заливают карболовым фуксином Циля.
2. Нагревают 3–5 мин до появления паров (3–5 раз).
3. Охлаждают, снимают бумагу, промывают водой.
4. Обесцвечивают 3% раствором HCl в 96% этаноле (30 с – 2 мин).
5. Промывают водой.
6. Дополнительная окраска метиленовым синим (1–2 мин).
7. Промывают, высушивают.
Результат:
Окраска по Цилю-Нильсену
> [!simple] Простыми словами: При окраске по Цилю-Нильсену бактерии туберкулёза выглядят как красные тонкие палочки на синем фоне. Их не обесцветить кислотой — поэтому они называются «кислотоустойчивыми».
Позволяет выявить термостойкие споры (эндоспоры) у бацилл и клостридий.
Метод:
1. На фиксированный мазок при помощи стеклянной палочки наносят 0,5% раствор HCl и выдерживают 1–2 мин для травления оболочек спор (или обрабатывают 5% хромовой кислотой).
2. Промывают водой.
3. Окрашивают карболовым фуксином Циля с нагреванием (4–5 мин).
4. Обесцвечивают 5% раствором серной кислоты (1–2 с).
5. Дополнительно окрашивают метиленовым синим (1 мин).
Результат:
Капсула — слизистое образование вокруг клетки. Метод основан на создании контраста между препаратом и окружающей средой.
Метод:
1. На предметное стекло наносят каплю туши, смешивают с бактериальной культурой, делают мазок (как мазок крови).
2. Высушивают на воздухе, фиксируют спиртом (10–15 мин) или нагреванием.
3. Окрашивают кристаллическим фиолетовым (1–2 мин).
4. Промывают, высушивают.
Результат:
Капсула бактерий
Зёрна волютина (полифосфатные включения) содержатся у дифтерийной палочки.
Метод:
1. Краситель Нейссера (1-2 части метиленового синего + 1 часть кристаллического фиолетового) — 30–60 с.
2. Промывание водой.
3. Обработка раствором Люголя (30 с).
4. Окраска дополнительным красителем (везувин или хризоидин) — 1 мин.
Результат:
> [!example] Пример: Возбудитель дифтерии (Corynebacterium diphtheriae) при окраске по Нейссеру имеет вид палочек с тёмно-синими утолщениями на концах (так называемые метахроматические зёрна). Это отличает её от непатогенных коринебактерий.
Жгутики — тонкие структуры (10–20 нм), невидимые в световой микроскоп без специальной окраски.
Метод серебрения:
1. Мазок готовят специальным образом (спиртовой фиксацией без нагревания).
2. Обрабатывают протравой (танин, раствор хлорного железа).
3. Окрашивают аммиачным серебром (нагревание).
Результат:
| Метод | Цель | Красители | Результат | Основные группы микроорганизмов |
|---|---|---|---|---|
| Простой | Обзорная микроскопия | Метиленовый синий, фуксин | Одноцветные клетки | Все |
| Грам | Дифференцировка Гр⁺/Гр⁻ | Крист. фиолетовый, фуксин | Гр⁺ — фиолет., Гр⁻ — крас. | Кокки, палочки |
| Циль-Нильсен | Кислотоустойчивые | Карболовый фуксин, мет. синий | Кислотоуст. — красные | Мycobacterium |
| Ожешко | Споры | Карб. фуксин, мет. синий | Споры — красные, вегет. — синие | Bacillus, Clostridium |
| Гинс | Капсулы | Тушь, крист. фиолетовый | Капсула — светлый ореол | Klebsiella, Pneumococcus |
| Нейссер | Зёрна волютина | Мет. синий, везувин | Волютин — тёмно-синий | Corynebacterium |
| Морозов | Жгутики | Аммиачное серебро | Жгутики — чёрные | Vibrio, Pseudomonas |
1. Качество мазка — равномерный тонкий слой (1–2 клетки в толщину), отсутствие агломератов.
2. Фиксация — обеспечивает прикрепление клеток к стеклу, сохранение морфологии; недогрев ведёт к смыву клеток, перегрев — к деформации.
3. Время экспозиции — недостаточное — слабое окрашивание, избыточное — фоновая окраска.
4. Свежесть красителей — старые растворы могут давать неравномерное окрашивание.
5. pH среды — сдвиг pH влияет на ионизацию красителя и поверхности клеток (оптимум pH 7,0–7,2).
> [!critical] Ключевой факт: Окраска по Граму — фундаментальный дифференциальный метод, основанный на разной способности бактерий удерживать комплекс кристаллического фиолетового с йодом после обработки спиртом. Решающую роль играет толщина и структура пептидогликанового слоя клеточной стенки, а не её химический состав как таковой. Грамположительные бактерии имеют толстый многослойный пептидогликан (20–80 нм) и удерживают комплекс, грамотрицательные — тонкий (5–10 нм) и обесцвечиваются. Именно эта особенность определяет окраску и является первым шагом в бактериологической идентификации.
---
Итог. Морфологические свойства (форма, размер, расположение) и тинкториальные свойства (способность к окраске по Граму, кислотоустойчивость, наличие метахромазии) составляют основу первичной идентификации бактерий. Совокупность методов окраски — от простых дифференциальных (Грам, Циль-Нильсен) до специальных (споры, капсулы, жгутики) — позволяет выявить структурные особенности клетки и классифицировать микроорганизмы по таксономическим группам.