Основные методы исследования морфологии бактерий

Микробиология, вирусология — СПбГПМУ, Педиатрический факультет

Основные методы исследования морфологии бактерий

Морфология бактерий изучается с помощью комплекса инструментальных и красительных методов. Основой является микроскопия, позволяющая визуализировать клетки, а методы окраски обеспечивают контрастирование, идентификацию структуры и дифференциацию микроорганизмов.

Микроскопия

Используются различные виды микроскопии в зависимости от целей исследования:

Световая микроскопия

• Иммерсионная микроскопия — стандартный метод для изучения окрашенных препаратов. Используется иммерсионное масло (n ≈ 1.5) для увеличения разрешающей способности до ~0.2 мкм. Объектив ×90–100, окуляр ×10–15.
• Фазово-контрастная микроскопия — позволяет наблюдать живые неокрашенные бактерии за счёт преобразования фазовых различий в амплитудные. Особенно полезна для изучения подвижности, формы, деления.
• Темнопольная микроскопия — основана на боковом освещении; объекты выглядят светящимися на тёмном фоне. Применяется для тонких структур (жгутики, спирохеты, трепонемы).
• Люминесцентная (флуоресцентная) микроскопия — использует флуорохромы (акридиновый оранжевый, аурамин, FITC-меченые антитела). Высокая специфичность, позволяет выявлять бактерии в смешанной культуре, в тканях, а также оценивать жизнеспособность (свечение дифференцировано по цвету).

> [!simple] Простыми словами: Световая микроскопия – это как рассматривать бактерии через лупу с подсветкой и красителями. Фазовый контраст и тёмное поле помогают видеть прозрачные живые клетки без окрашивания.

Электронная микроскопия

• Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) — пучок электронов проходит через ультратонкий срез. Разрешение до 0.1–0.2 нм. Позволяет изучать ультраструктуру: клеточную стенку, мембраны, рибосомы, нуклеоид, жгутики, пили.
• Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) — регистрирует отражённые электроны с поверхности образца. Даёт объёмное изображение поверхности бактерий, их колоний, биоплёнок.

> [!example] Пример: С помощью ПЭМ выявляют наличие капсулы у _Bacillus anthracis_ (в виде электронно-прозрачной зоны), а СЭМ демонстрирует расположение жгутиков по перитрихиальному типу у _Escherichia coli_.

Методы окраски микробов и их отдельных структур

Окраска проводится для увеличения контраста, выявления морфологических и тинкториальных свойств. Красители делятся на основные (метиленовый синий, кристаллический фиолетовый, фуксин) и кислые (эозин, кислый фуксин). Основные красители активно связываются с кислыми компонентами клетки (нуклеиновые кислоты, пептидогликан).

Простые методы окраски

Препарат обрабатывают одним красителем (например, метиленовым синим или разведённым фуксином). Позволяет оценить форму, размер, взаимное расположение клеток, наличие спор (если они не прокрашиваются).

Сложные (дифференциальные) методы окраски

Включают несколько этапов: протравливание, дифференцировка, контрастное окрашивание.

1. Окраска по Граму (основной метод дифференциации)

• Этапы: кристаллический фиолетовый → раствор Люголя (фиксация комплекса) → обесцвечивание спиртом/ацетоном → контрастирование фуксином (сафранином).
• Результат: Грам-положительные (фиолетовые) – толстый пептидогликан задерживает комплекс. Грам-отрицательные (розовые/красные) – тонкий пептидогликан + внешняя мембрана, комплекс вымывается.
• Значение: первичная идентификация, основа антибиотикотерапии.

> [!critical] Ключевой факт: Окраска по Граму — обязательный этап первичной характеристики любой бактериальной культуры. Ошибки возможны при использовании старых культур или неправильном обесцвечивании.

2. Окраска по Цилю-Нильсену (кислотоустойчивые бактерии)

• Используют карболовый фуксин с нагреванием (прогревание/пропускание через пламя) → обесцвечивание 3% HCl в спирте → контрастирование метиленовым синим.
• Результат: кислотоустойчивые (Mycobacterium spp., Nocardia) — красные (фуксин удерживается из-за высокого содержания миколовых кислот), некислотоустойчивые — синие.
• Модификации: метод Мюллера-Клинга (холодная окраска), окраска по Цилю-Нильсену для спор (см. ниже).

3. Окраска по Нейссеру (волютин, метахроматические гранулы)

• Этапы: метиленовый синий + уксусная кислота → обесцвечивание грамотрицательного фона → контрастирование везувином или хризоидином.
• Результат: волютин (полифосфатные включения) — тёмно-синий или фиолетовый, цитоплазма — жёлто-коричневая. Используется для выявления _Corynebacterium diphtheriae_ (зерна волютина на полюсах).

4. Окраска по Бурри-Гинсу (капсулы)

• Негативная окраска: тушь смешивают с микробной взвесью и растирают на стекле. Затем высушивают и контрастируют (например, фуксином).
• Результат: капсула — бесцветная зона вокруг окрашенной клетки на тёмном фоне туши.
• Аналоги: метод Гинса-Муромцева (фиксация спиртом, окраска фуксином без туши — капсула слабо прокрашивается).

5. Окраска спор по Ожешко (модификация Циля-Нильсена)

• Прогревание клеток с малахитовым зелёным → обесцвечивание водой → контрастирование сафранином или фуксином.
• Результат: споры — зелёные, вегетативные клетки — красные/розовые.
• Альтернатива: метод Циля-Нильсена для спор (с карболовым фуксином и прогревом) — споры красные, клетки голубые.

6. Окраска жгутиков (метод Лёффлера, серебрение по Морозову)

• Требует специальной подготовки: предварительное протравливание (танин, хлорид ртути) для набухания жгутиков, затем окраска серебром или карболовым фуксином.
• Результат: жгутики видны как тонкие нити, отходящие от тела бактерии. Позволяет определить тип жгутикования (моно-, лофо-, амфи-, перитрихи).

7. Окраска нуклеоида (по Фёльгену, Романовскому-Гимзе)

• По Фёльгену: гидролиз HCl (удаление пуринов) → реакция с реактивом Шиффа — ДНК окрашивается в красный/фиолетовый.
• По Романовскому-Гимзе: комплексный краситель (азур, эозин, метиленовый синий) — ядерные структуры сине-фиолетовые, цитоплазма розовая. У бактерий нуклеоид диффузен, но заметен как зона слабой окраски.

8. Окраска клеточной стенки (пептидогликана)

• Специфические методы (например, флуоресцентные лектины, красители на N-ацетилглюкозамин) редко применяются в рутинной практике. На практике о характере стенки судят по Граму.

> [!example] Пример: При подозрении на дифтерию делают мазок из зева, окрашивают по Нейссеру — характерные палочки с полярными метахроматическими зёрнами подтверждают диагноз.

Заключение по методам

Выбор метода микроскопии и окраски определяется задачей: первичная идентификация (Грам, Циль-Нильсен), выявление капсулы (Бурри-Гинс), спор (Ожешко), жгутиков (серебрение), ультраструктуры (электронная микроскопия). Комбинирование методов даёт полную морфологическую характеристику.

> [!critical] Ключевой факт: Основной инструментальный метод — световая иммерсионная микроскопия с окраской по Граму (базовая дифференциация). Основной электронный метод — просвечивающая микроскопия для ультраструктуры. Для выявления конкретных структур применяют специализированные окраски (капсулы, споры, жгутики, волютин).

---

Итог. Исследование морфологии бактерий включает микроскопию (световую и электронную) и комплекс окрасочных методов, каждый из которых предназначен либо для общей характеристики (Грам), либо для идентификации отдельных структур (капсула, спора, жгутик, включения). Знание этих методов необходимо для корректной идентификации возбудителя и выбора тактики антимикробной терапии.

Все вопросы раздела: Подготовка к экзамену по Микробиологии, вирусологии