Гистология, цитология, эмбриология — БФУ, Лечебное дело
Живая ткань непрозрачна для проходящего света, мягка и быстро разрушается после извлечения из организма. Чтобы рассмотреть её в световом микроскопе, из ткани готовят тонкий окрашенный срез, сохранивший прижизненное строение. Последовательность действий, ведущая к такому срезу, составляет содержание гистологической техники. Каждый этап вносит свои изменения в ткань, и знание этих изменений нужно, чтобы отличить структуру от артефакта, то есть от искажения, возникшего при обработке.
Кусочек ткани берут возможно быстрее после смерти или удаления органа, пока не развился аутолиз. Размер кусочка не превышает 1 см, а толщина 3-5 мм: фиксирующая жидкость проникает в ткань медленно, и центр крупного объекта успеет разрушиться раньше, чем до него дойдёт фиксатор. Инструмент должен быть острым, ткань нельзя сдавливать пинцетом, иначе в срезе появятся зоны смятых клеток.
Фиксация прекращает посмертные изменения, закрепляя прижизненную структуру за счёт денатурации белков и образования поперечных сшивок между их молекулами. Одновременно фиксатор уплотняет ткань и повышает её сродство к красителям.
Применяют простые и сложные фиксаторы. Из простых чаще всего используют 10 % нейтральный забуференный формалин: он проникает глубоко, хорошо сохраняет общую архитектонику и совместим с большинством окрасок. Этанол фиксирует быстрее, но вызывает заметное сморщивание ткани и растворяет липиды. Сложные фиксаторы, такие как жидкость Буэна, смесь Ценкера, фиксатор Карнуа, составлены так, чтобы недостатки отдельных компонентов взаимно компенсировались.
Продолжительность фиксации зависит от объёма кусочка и составляет от нескольких часов до суток. Передержка в формалине снижает окрашиваемость ядер.
Вода несмешиваема с заливочными средами, поэтому её последовательно вытесняют из ткани спиртами возрастающей концентрации, от 50-60 % до абсолютного. Ступенчатость обязательна: перенос из воды сразу в крепкий спирт вызывает резкое сморщивание клеток.
Затем спирт замещают промежуточной средой, растворяющей и спирт, и парафин. В этом качестве используют ксилол, толуол или хлороформ. На этом этапе ткань становится прозрачной, отчего он получил название просветления.
Заливка придаёт ткани однородную плотность, достаточную для получения тонкого среза. Чаще всего применяют парафин: кусочек выдерживают в расплавленном парафине при 56-58 °C, после чего заливают в форму и охлаждают. Для исследований, требующих сохранения структуры на ультраструктурном уровне, используют эпоксидные смолы, для крупных объектов и объектов с большой разницей плотности - целлоидин.
Отдельный вариант - замораживание. Кусочек замораживают в жидком азоте или в криостате и режут без проводки. Этот способ занимает минуты вместо суток и сохраняет липиды и активность ферментов, поэтому применяется для срочной биопсии во время операции и для гистохимических реакций.
Срезы получают на микротоме. Толщина парафинового среза для световой микроскопии составляет 5-7 мкм, срезы с замороженной ткани толще, 10-20 мкм. Для электронной микроскопии на ультратоме со стеклянным или алмазным ножом готовят ультратонкие срезы толщиной 50-100 нм.
Срез расправляют на тёплой воде и наносят на предметное стекло. Перед окрашиванием парафин удаляют ксилолом, а ткань вновь проводят через спирты нисходящей концентрации к воде, поскольку большинство красителей водорастворимы.
Этапы приготовления препарата для электронной микроскопии
Неокрашенная ткань почти не даёт контраста. Окрашивание придаёт разным её компонентам разный цвет за счёт избирательного связывания красителя с определёнными химическими группами.
По химической природе и сродству красители делят на три группы.
Кислые красители несут отрицательно заряженный хромофор и связываются с положительно заряженными, основными, компонентами ткани: цитоплазматическими белками, коллагеновыми волокнами, митохондриями. Такие структуры называют оксифильными, или ацидофильными. Типичные представители: эозин, кислый фуксин, пикриновая кислота, оранжевый G.
Основные красители несут положительно заряженный хромофор и связываются с кислыми компонентами: нуклеиновыми кислотами ядра и рибосом, гликозаминогликанами межклеточного вещества. Эти структуры называют базофильными. Представители: гематоксилин, азур, метиленовый синий, толуидиновый синий, кармин.
Нейтральные красители представляют собой смесь кислого и основного компонентов и окрашивают одновременно и те, и другие структуры. На этом построен азур-эозин по Романовскому, основная окраска для мазков крови: он позволяет в одном препарате различить ядра лейкоцитов и специфическую зернистость их цитоплазмы.
Структура, окрашивающаяся и кислым, и основным красителем, называется нейтрофильной, или гетерофильной.
Отдельно стоит метахромазия - изменение цвета красителя при связывании с тканью. Толуидиновый синий окрашивает гранулы тканевых базофилов не в синий, а в красно-фиолетовый цвет: это происходит при взаимодействии с высокополимерными гликозаминогликанами, прежде всего с гепарином.
Универсальной обзорной окраской служит гематоксилин-эозин. Гематоксилин как основной краситель окрашивает ядра в фиолетово-синий цвет, эозин как кислый окрашивает цитоплазму и межклеточное вещество в розовый. Эта пара даёт представление об общем строении ткани и применяется для первичного просмотра любого препарата.
Когда обзорной картины недостаточно, применяют специальные методы, избирательные к отдельным компонентам.
После окраски срез вновь обезвоживают, просветляют в ксилоле и заключают под покровное стекло в среду с показателем преломления, близким к стеклу: канадский бальзам, пихтовый бальзам или синтетические смолы. Заключение защищает срез от высыхания и механического повреждения и устраняет рассеяние света на границе сред, без чего изображение остаётся мутным.
Все вопросы раздела: Подготовка к экзамену по гистологии, цитологии, эмбриологии